【摘要】 以霉酚酸產生菌1321#為出發菌株，采用紫外線誘變并復合重金屬Cr6+、Cu2+抗性株篩選，獲得一株遺傳性狀穩定且搖瓶發酵水平提高86.6%的164#高產菌株。經發酵配方優化，該菌株的搖瓶單位再度提升了5.5%，顯示出了高產潛力。
【關鍵詞】 霉酚酸； 誘變； 重金屬離子； 抗性篩選
ABSTRACT A mycophenoilc acid (MPA) producing strain Penicillium brevicompactum #1321 was treated by UV, followed by resistance selection with heavy metal Cr6+ and Cu2+. A stable strain #164 was obtained with the potency of MPA higher by 86.6% than starting strain in shaking culture. The potency was further improved by 5.5% in the optimized fermentation medium.
KEY WORDS Mycophenoilc acid; Mutagenesis; Heavy metal ion; Resistant screening
霉酚酸(mycophenoilc acid，MPA)為短密青霉(Penicillium brevicompactum)產生的抗真菌、抗腫瘤并具免疫抑制作用的抗生素［1］。MPA是次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶的可逆性抑制劑，能選擇性地抑制淋巴細胞活性，它的2-乙基酯類衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制劑，在臨床器官移植和自身免疫性疾病的治療方面展示了良好的應用前景。做為合成MMF的前體化合物，提高MPA的工業化水平對于生產企業來說十分重要。
MPA產生菌原始菌株的產量有限，其高產菌株的選育研究近年來漸成熱點。張琴等［2］報道采用紫外線及亞硝基胍誘變產生菌，以MPA和三氟乙酸為抗性篩選標記，篩選到了高產突變株；楊亞勇等［3］報道紫外線和亞硝酸復合誘變MPA產生菌的原生質體，經原生質體再生獲得了高產菌株。本文報道了應用紫外誘變與定向篩選重金屬離子抗性株相結合的方式，進行MPA育種研究，并獲得了高產穩定的突變株。
1 材料與方法
1.1 出發菌種
短密青霉(Penicillium brevicompactum)1321#。
1.2 培養基及培養條件
(1)分離及斜面培養 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，26℃培養5d～7d。
(2)種子培養 淀粉10g，葡萄糖5g，酵母粉3g，氯化鈉1g，硫酸鎂0.5g，碳酸鈣1g，自來水1000ml，自然pH。26℃，220r/min搖床，培養2d。
(3)發酵培養 淀粉12g，蔗糖50g，玉米漿50g，魚粉蛋白胨2g，酵母粉13g，硫酸銨4g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈣2g，碳酸鈣0.5g，自來水1000ml，自然pH。26℃，220r/min搖床，培養7d。
1.3 菌種誘變與篩選
(1)紫外照射單因子處理 由出發菌株的成熟斜面制得單孢子懸液置平皿中，紫外燈(30W，波長254nm， 距離40cm)照射4～5min， 孢子液適當稀釋后涂布于PDA平板培養基上。培養5d后挑取單菌落進行搖瓶篩選。
(2)紫外照射復合Cr6+、Cu2+平板抗性處理 制備含有0.6%、0.7%和0.8%鉻酸鈉以及0.02%、0.05%和0.1%硫酸銅的PDA平板，將UV處理過的孢子液適當稀釋并涂布于含Cr6+、Cu2+平板培養基上，培養5d～7d后挑選孢子豐富、菌落直徑相對較大的抗性菌落進行搖瓶篩選。
1.4 發酵液單位檢測
樣品處理 定量吸取發酵液，加入1.5倍的無水乙醇，充分振蕩1h，3000r/min離心10min。取上清液由HPLC測效價。
HPLC測定 色譜柱Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm)；流動相為甲醇∶0.1%醋酸(70∶30)；檢測波長250nm；柱溫40℃。
MPA對照品為Sigma公司產品。
2 結果
2.1 菌種誘變系譜
2.2 搖瓶篩選結果
出發菌株1321#經過UV誘變處理結合Cr6+、Cu2+抗性株篩選，最終獲得164#高產突變株，其搖瓶產量比1321#提高了86.6%(表1)。
由表1可見，UV+Na2CrO4復合處理篩選到的942#菌株的產量提高幅度最大，隨后進行的UV+CuSO4復合處理得到的164#菌株其發酵單位進一步提升。
2.3 高產突變株的菌落形態變化
164#高產突變株的菌落形態與原始菌株1321#相比有了較大變化。1321#為圓形扁平狀菌落，而164#的菌落中央凸起，呈對稱性放射褶皺狀。且有直徑變小、孢子量減少的趨勢。表1 三種誘變篩選方式獲得正變株(系譜菌株)的相對搖瓶產量以出發菌株CK1321#搖瓶產量為100%計。2.4 高產菌株遺傳穩定性考察
164#菌株經連續四次斜面傳代后與F1代進行搖瓶發酵單位的比較，其子代效價與F1代基本持平。證明該菌株的遺傳穩定性良好。
2.5 發酵配方優化
以164#做為試驗菌株，對發酵培養基中的淀粉、蔗糖、酵母粉、魚粉蛋白胨、玉米漿進行U15(155)均勻設計試驗。經驗證，配方優化后164#菌株的搖瓶單位提高了5.5%。
3 討論
我公司的MPA產生菌系從土壤中分離得到的野生菌株，經過前期的誘變育種工作，本試驗出發菌株1321#的發酵能力已達到產業化水平。為進一步增強產品的市場競爭力，我們面臨的任務是選用快速有效的育種手段，短期內將菌種的單位產量大幅提高，以滿足生產的需求。
在菌種選育過程中，誘變和篩選方法的選擇是十分重要的。Cu2+、Cr6+等重金屬離子對微生物有一定毒性［4］，當培養基中的重金屬離子達到一定濃度時大多數產生菌的生長被抑制，只有對該金屬離子具有抗性的菌株才能生長。抗性的機制可能是由于菌體分泌大量產物或其中間體和有毒的金屬離子結合，形成無毒或低毒的復合物以解除對菌體自身的抑制作用［5］，并使之失去終產物的反饋控制。這樣就可以從金屬離子抗性突變株中篩選到能大量產生目的產物的高產菌株。
我們對1321#菌株采用了包括UV誘變以及UV復合Cr6+、Cu2+抗性篩選的方法，多輪選育后獲得164#高產突變株,再經發酵配方優化，其搖瓶產量比出發菌株累計提高92.1%，為生產成本的降低奠定了良好的基礎。