【摘要】 以青霉素生產(chǎn)菌種87117#為出發(fā)菌種，采用紫外線誘變復(fù)合前體動態(tài)后處理的方法，結(jié)合限氧條件下的搖瓶篩選，從177支前體抗性株中篩出XY-137#高產(chǎn)突變株。該菌株搖瓶效價平均提高了8.8%,且遺傳特性穩(wěn)定，單位菌絲產(chǎn)物合成能力強。XY-137#菌株在百噸罐中經(jīng)過近百批的生產(chǎn)驗證，其放罐效價、發(fā)酵指數(shù)、罐批產(chǎn)量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。
【關(guān)鍵詞】 紫外誘變； 動態(tài)后處理； 理性篩選； 青霉素高產(chǎn)菌株
ABSTRACT Using Penicillium chrysogenum #87117 as starting strain, a penicillin high yield strain #XY-137 was obtained by UV irradiation combined with precursor-resistant strain in shake flask selection method under limited oxygen. Penicillin potency of strain #XY-137 was increased by 8.8% cultured in shaking flasks. Average productivity of about 100 batches fermentation level was increased by 2.69%～5.66% than that of strain #87117 in 100-ton fermentor.
KEY WORDS UV mutagenesis; Dynamic post-treatment; Rational screening; Penicillin high-producing strain
由于青霉素原料的后加工與半合成領(lǐng)域愈來愈廣泛，世界青霉素市場競爭十分激烈。生產(chǎn)廠家唯有不斷地提高生產(chǎn)水平，降低生產(chǎn)成本以增強企業(yè)的競爭力，而優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌種的選育和應(yīng)用是其中的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。
隨著青霉素菌種生產(chǎn)能力的提高，傳統(tǒng)育種方法的局限性越來越明顯。理性化篩選是應(yīng)用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的原理，根據(jù)已知或可能的目的產(chǎn)物生物合成途徑的調(diào)控機制和產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。我們依據(jù)理性育種的理念，參照現(xiàn)有生產(chǎn)條件設(shè)立基本篩選模型，采用紫外輻射震動工業(yè)生產(chǎn)菌種穩(wěn)定的遺傳結(jié)構(gòu)，再輔以限氧條件下耐前體突變株的篩選，達到選育高產(chǎn)菌株的目的。
1 材料與方法
1.1 出發(fā)菌種
青霉素生產(chǎn)菌種Penicillium chrysogenum 87117#。1.2 培養(yǎng)基
(1)分離及斜面培養(yǎng)基 蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl、CaSO4、微量元素、瓊脂。
(2)種子培養(yǎng)基 以蔗糖、玉米漿為碳、氮源。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基 以乳糖、玉米漿為主要碳、氮源，加無機鹽類組成。
1.3 菌種誘變與篩選
(1)紫外誘變 將出發(fā)菌株的單孢子懸液置紫外燈下40cm處照射90s。
(2)前體動態(tài)后處理 定量吸取經(jīng)過紫外線照射后的孢子液，分別加入含有不同劑量的前體(苯乙酸胺)的種子培養(yǎng)基試管中，使每支試管的前體終濃度在0～4.8%之間。將上述試管置25℃恒溫振蕩培養(yǎng)18h左右，然后稀釋分離在固體培養(yǎng)基平板上。
(3)前體抗性菌落檢出 平板置25℃恒溫培養(yǎng)8d。從耐受不同濃度前體處理后長出的抗性菌落中挑選孢子相對豐富、組織比較致密的菌落進行斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，以備搖瓶篩選。
(4)搖瓶定向篩選低氧耗、低菌絲量的高產(chǎn)菌株 將搖瓶機轉(zhuǎn)速由通常的220r/min降至160r/min，在低通氣條件下進行搖瓶篩選。后續(xù)的高產(chǎn)株特性考察和工藝優(yōu)化均在此條件下進行。
搖瓶篩選考察指標(biāo)為發(fā)酵效價和菌絲生長量(packed mycelial volume,pmv)。
1.4 樣品檢測
發(fā)酵液倒入刻度離心管中，3000r/min離心10min。取上清液，用美國OI公司Flow SolutionⅣ化學(xué)自動分析儀檢測其中的青霉素效價(u/ml)。沉淀部分所占體積與發(fā)酵液體積的比值即為pmv(%)。
2 結(jié)果
2.1 XY-137#高產(chǎn)突變株的選育
出發(fā)菌株87117#先經(jīng)過兩次自然選育，然后采用紫外線復(fù)合前體動態(tài)后處理，挑取177支抗性株，在限氧條件下進行搖瓶篩選。于3.84%前體耐受濃度下獲得XY-137#高產(chǎn)突變株，以87117#為對照，其5d和7d搖瓶相對效價分別為107.4%和110.3%，搖瓶效價平均提高了8.8%。
2.2 XY-137#菌株特性考察
(1)菌種純度 XY-137#菌株自然分離后正常型菌落達96.3%，符合上生產(chǎn)罐的要求。
(2)斜面周期 XY-137#與出發(fā)菌株相比其斜面外觀有所改變，孢子長勢較弱，顏色明顯變淺。若仍按原周期培養(yǎng)斜面，則種子瓶的培養(yǎng)時間需延長4～6h。經(jīng)過試驗比較，將斜面培養(yǎng)周期推后1d，種子瓶生長正常，且搖瓶前期發(fā)酵效價略有提高。
(3)單位菌絲產(chǎn)物合成能力 由圖1可知，與出發(fā)菌種相比XY-137#菌株的搖瓶效價有顯著提高，而菌絲量較低，說明XY-137#菌株單位菌絲產(chǎn)量明顯優(yōu)于87117#對照菌種。
1：87117#相對效價； 2：XY-137#相對效價；
3：87117#菌絲生長量； 4：XY-137#菌絲生長量
圖1 XY-137#與87117#菌種搖瓶相對效價和菌絲量比較 (4)穩(wěn)定性試驗 XY-137#菌株經(jīng)斜面?zhèn)鞔筮M行搖瓶考察，F1～F4代相對效價依次為100%、98.9%、101.1%和99.7%，證明其穩(wěn)定性良好。
2.3 XY-137#菌株搖瓶工藝優(yōu)化
(1)培養(yǎng)基改良 進行了多輪均勻設(shè)計試驗。種子瓶經(jīng)回歸分析得到的最優(yōu)配方中，減少了質(zhì)量不易控制的玉米漿加量，增加適量的無機氮源，碳源比例也稍做了增加，優(yōu)化后種子瓶的菌濃明顯增大，發(fā)酵效價提高了7.5%。
發(fā)酵培養(yǎng)基則基于大罐的用料和配比，嘗試添加適量固形有機氮源來穩(wěn)定搖瓶效價。經(jīng)搖瓶發(fā)酵試驗，在多種有機氮源中最終選擇加入少量的麩質(zhì)粉，搖瓶效價提高了6%左右。
(2)增加前體補入量 考慮到XY-137#系耐前體突變株，故欲增加前體補入量，以滿足高產(chǎn)菌株的需要。結(jié)果顯示將前體濃度調(diào)高3%，補入體積不變，XY-137#菌株搖瓶效價提高了9.4%(表1)。表1 前體增量試驗結(jié)果
2.4 XY-137#菌株生產(chǎn)試驗
XY-137#菌株在100m3罐中考察其生產(chǎn)能力及對原材料和工藝條件的適應(yīng)性。經(jīng)統(tǒng)計，該菌株放罐95批，在發(fā)酵周期短4h、主要原材料消耗沒有增加的情況下，XY-137#菌株的放罐效價、發(fā)酵指數(shù)、罐批產(chǎn)量比同期87117#菌株分別提高了3.83%、5.66%和2.69%。
上罐試驗同時還證實XY-137#菌株不僅具備高產(chǎn)能力，而且發(fā)酵液粘度比87117#有所降低，可以減少動力消耗。
3 討論
對于青霉素這樣產(chǎn)量已達較高水平的老品種，其產(chǎn)生菌久經(jīng)人工選育，不論在遺傳背景或生理特性方面都發(fā)生了復(fù)雜的變化。因此在做進一步誘變育種時，不但要考慮誘變劑的選擇，更重要的是對篩選方法作合理的設(shè)計，使變異株產(chǎn)量的提高和主要性狀的改變能明顯地表達出來。有報道根據(jù)青霉素的生物合成途徑在固體培養(yǎng)基上加入纈氨酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸等底物進行抗性篩選［1，2］；或采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，使兩株營養(yǎng)缺陷型菌株融合，篩選融合子［3］均取得了一定的效果。
前體對青霉素產(chǎn)生菌有毒性，能抑制其孢子發(fā)芽和菌絲的分支［4］。篩選以前體為標(biāo)記的耐前體高產(chǎn)突變株，不僅可以解除毒性，而且使前體直接摻入抗生素的生物合成而提高產(chǎn)量［5］。由于動態(tài)后處理有富集正變株的作用［6］，故可以增加高產(chǎn)株的篩出幾率。
確定篩選條件決定著菌種選育的方向。特別是生產(chǎn)菌種，定向篩選的目標(biāo)皆應(yīng)來自大生產(chǎn)的需要。在發(fā)酵工業(yè)中，降低氧耗、降低動力消耗對生產(chǎn)成本的降低有著重要意義。本試驗在低通氣條件下篩選菌絲量較少的高產(chǎn)菌株，使選育到的菌株更具實際應(yīng)用價值。
生產(chǎn)實踐證明，XY-137#高產(chǎn)菌株特性達到理性篩選設(shè)計要求。