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　　SPF級(jí)ICR小鼠216只，雄性，6周齡，體重(20±0.5)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK吉20072003。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》〔4〕。煙曲霉共7株，其中，強(qiáng)毒株JLC 50134由日本國(guó)立千葉大學(xué)真菌醫(yī)學(xué)研究中心饋贈(zèng)，編號(hào)IFM 40808。JLC 30542、JLC 30890、JLC 30859、JLC 30566、JLC 31106及JLC 31753分離自臨床患者和環(huán)境樣本，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，由吉林大學(xué)真菌研究中心菌種保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center)分離并保藏。
   
　　實(shí)驗(yàn)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購(gòu)自Difco公司，注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  孢子懸液的制備 

　　將煙曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d。用含有0.05%吐溫 80的生理鹽水制備一定濃度的孢子懸液。將孢子懸液進(jìn)行連續(xù)稀釋后涂布在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，與涂布的孢子懸液濃度進(jìn)行比較，計(jì)算孢子活力〔（菌落計(jì)數(shù)×稀釋倍數(shù)）/孢子懸液濃度〕＞90%可進(jìn)行接種〔5〕。

　　1.2.2  接種濃度的確定 

　　配制煙曲霉JLC 50134的孢子懸液（濃度：1.0×103～1.0×109 CFU/ml共7個(gè)梯度）感染小鼠，每個(gè)濃度10只，預(yù)計(jì)選用3 d內(nèi)導(dǎo)致50%小鼠死亡的孢子懸液濃度作為實(shí)驗(yàn)接種濃度〔5〕。

　　1.2.3  動(dòng)物的免疫抑制和分組 

　　隨機(jī)挑選小鼠216只，分9組（感染組7組，陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組各1組），每組8只。飼養(yǎng)于IVC鼠籠中，室溫（24℃～26℃），保持濕度，日照14 h和黑夜10 h交替進(jìn)行，墊料、食物和水滅菌處理。飲水中加入四環(huán)素（1 mg/ml）防止細(xì)菌感染，實(shí)驗(yàn)過程中不限食水。感染組和陰性對(duì)照組第1、4天腹腔注射環(huán)磷酰胺（150 mg/kg）進(jìn)行免疫抑制〔5〕，第5天尾靜脈采血計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞數(shù)量，通過白細(xì)胞減少的程度確定小鼠是否受到免疫抑制。

　　1.2.4  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的接種 

　　小鼠通過吸入乙醚麻醉，使其昏迷超過1 min，抑制吞咽反射。取30 μl不同濃度或不同菌株的煙曲霉孢子懸液（孢子活力＞90%）滴入一側(cè)鼻孔；陰性對(duì)照組小鼠進(jìn)行同樣麻醉，接種等量的含有0.05%吐溫80的生理鹽水；正常對(duì)照組小鼠不注射孢子懸液和生理鹽水。

　　1.2.5  動(dòng)物感染過程監(jiān)測(cè)、臟器處理及感染菌株鑒定 

　　感染后15 d內(nèi)，每日觀察小鼠的生存狀態(tài)，測(cè)量體重，計(jì)算生存率；取感染死亡小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟進(jìn)行組織勻漿，稀釋至濃度為1.0×10-3g/ml。取200 μl涂布在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將臟器剩余部分用10%（v/v）甲醛固定，浸入石蠟，切片，HE染色。15 d后，將仍然存活的小鼠頸椎脫臼法處死，處死小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟的操作同前。將組織勻漿培養(yǎng)得到的菌株，利用小瓊脂塊培養(yǎng)法進(jìn)行初步鑒定。提取菌株DNA，利用真菌通用引物(E1m4和rE2m4)擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素b基因片段〔6〕，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。將測(cè)定結(jié)果與GenBank中煙曲霉序列進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證該菌株是否為煙曲霉。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.2.6  煙曲霉致病力的比較 

　　通過綜合分析生存率、中位生存期、平均體重、肺組織勻漿的菌落計(jì)數(shù)及其組織病理學(xué)變化來比較7株煙曲霉的致病力。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理   應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)生存率進(jìn)行Logrank檢驗(yàn)，對(duì)Log (CFU/gram)進(jìn)行方差分析。

　　2  結(jié)果

　　2.1  接種濃度的確定 

　　接種煙曲霉JLC 50134 共7個(gè)濃度的孢子懸液，生存率計(jì)算結(jié)果見表1。發(fā)現(xiàn)濃度為1.0×107 CFU/ml時(shí)，在第3天50%的小鼠死亡，確定該濃度為實(shí)驗(yàn)接種濃度。表1  煙曲霉不同濃度孢子感染小鼠生存率(略)

2.2  小鼠的生存狀態(tài) 

　　注射環(huán)磷酰胺前，小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（7.2±0.23 ）×109 CFU/ml，注射環(huán)磷酰胺后第5天，小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1.5±0.45 ）×109 CFU/ml，證實(shí)小鼠處于免疫抑制狀態(tài)〔7〕。感染組小鼠接種孢子懸液2～3 d后，可見活動(dòng)減少；7～8 d后表現(xiàn)為消瘦、體重急速下降，甚至死亡。陰性對(duì)照組小鼠接種等量生理鹽水1～2 d內(nèi)，活動(dòng)減少，體重稍有下降，2 d后逐漸恢復(fù)正常，無死亡。正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)良好，體重上升。

　　2.3  小鼠生存率比較 

　　JLC 50134感染小鼠的生存率較低，接種后第2天開始出現(xiàn)小鼠死亡，第3天時(shí)迅速下降至50%，第4天時(shí)生存率僅為10%，第5天時(shí)生存率為0。而JLC 30566感染小鼠在第5天時(shí)才出現(xiàn)死亡，第6天時(shí)生存率達(dá)50%，此后再無下降。JLC 31106感染小鼠第5天生存率為75%，至第7天時(shí)下降至37.5%，第10天后生存率降至25%。另4株煙曲霉感染小鼠的生存率變化與JLC 31106感染小鼠相似。JLC 50134感染小鼠的中位生存期為4，JLC 30566感染小鼠的中位生存期為6，其他5組均為5。Logrank檢驗(yàn)結(jié)果為χ2=14.288，P<0.05。故可認(rèn)為7組小鼠總體生存率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明JLC 50134感染小鼠生存率較低，JLC 30566感染小鼠生存率較高。見圖1。

　　2.4  小鼠平均體重比較 

　　7組小鼠感染后平均體重均開始下降，JLC 50134感染小鼠平均體重下降的幅度和速度最大，第3～4天1 d內(nèi)小鼠平均體重下降約8.0 g，此后全部小鼠死亡。說明該菌感染造成的病理損害非常嚴(yán)重和迅速。JLC 30566感染小鼠的平均體重下降的幅度和速度最小，在第5～6天時(shí)下降約3.6 g，第7天后逐漸停止下降，隨后稍有上升。說明該菌感染造成的病理損害相對(duì)較輕。其他5組的變化介于上述兩者之間，下降幅度最大者1 d內(nèi)約為4.9 g。陰性對(duì)照組僅在接種生理鹽水后的5 d內(nèi)平均體重下降，隨后逐漸上升，在第9天后逐漸恢復(fù)至接種前水平，并不斷上升。見圖2。

　　2.5  小鼠的組織勻漿培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù) 

　　將小鼠肝臟、脾臟、腎臟和肺臟的組織勻漿涂布在培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3 d。除肺臟出現(xiàn)白色絨毛樣絲狀真菌菌落外，其他臟器均未見有菌生長(zhǎng)。3 d后菌落呈深綠色粉末狀，背面淡黃褐色。經(jīng)小瓊脂塊培養(yǎng)、乳酸酚棉蘭染色，顯微鏡下可見多呈45°角分支的分生孢子梗，燒瓶狀的頂囊，單層小梗位于頂囊上半部，小梗上可見鏈狀排列的球形分生孢子。結(jié)合菌落特征和顯微鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，初步鑒定為煙曲霉。計(jì)數(shù)7株菌感染小鼠肺組織勻漿的菌落數(shù)量，以Log (CFU/gram)表示，結(jié)果見表2。培養(yǎng)至第3天，陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組組織勻漿無菌生長(zhǎng)。7個(gè)感染組的組織勻漿菌落計(jì)數(shù)Log值在2.995 4±0.034 1之間，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明7組間小鼠肺組織勻漿培養(yǎng)得到的菌量一致。表2  7株煙曲霉感染小鼠肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù)（略）

　　2.6  菌株的分子生物學(xué)鑒定 

　　利用真菌通用引物擴(kuò)增得到約420 bp的線粒體細(xì)胞色素b基因片段，見圖3。經(jīng)過DNA序列測(cè)定以及序列比對(duì)，證實(shí)肺組織中分離得到的菌株是煙曲霉。

　　2.7  小鼠的肺臟組織病理學(xué)觀察 

　　感染組小鼠肺臟組織切片可見致密、有隔、寬度均一（3 ～ 6 μm）的菌絲，放射狀或片狀生長(zhǎng)。分生孢子梗多呈45°角分支，有時(shí)可見菌絲侵入血管，伴有肺組織的充血、出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
   
　　煙曲霉JLC 50134和JLC 30566感染小鼠的組織病理學(xué)變化見圖4。結(jié)果顯示，JLC 50134感染小鼠肺組織有出血和充血，大量孢子萌發(fā)成菌絲體（箭頭所示），聚集在血管周圍并侵入組織，造成肺泡壁的破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4a）。JLC 30566感染小鼠可見肺組織結(jié)構(gòu)較為完整，僅有少量出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4b）。通過比較7株煙曲霉感染小鼠的生存率、平均體重、組織病理學(xué)變化等指標(biāo)，篩選出了致病力最強(qiáng)的菌株JLC 50134和最弱的菌株JLC 30566。

3  討論
   
　　煙曲霉是一種腐生菌，在環(huán)境中分布廣泛，且其分生孢子體積微小，極易被人體吸入。若吸入肺泡中的煙曲霉分生孢子逃過宿主的免疫防御系統(tǒng)，就會(huì)萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，侵入肺組織并血行播散至全身引起感染。由于煙曲霉常侵犯免疫力低下的患者，因此選用環(huán)磷酰胺腹腔注射造成免疫抑制狀態(tài)，以提高小鼠對(duì)煙曲霉的敏感性。鑒于煙曲霉造成的IPA多為分生孢子經(jīng)鼻腔吸入肺內(nèi)所致〔8〕，因此本研究選擇鼻腔接種法進(jìn)行感染，相比氣管內(nèi)接種更加簡(jiǎn)便快速，對(duì)小鼠的傷害較少，能更真實(shí)的模擬感染過程，并可避免感染過程中小鼠的意外死亡；此外，該方法容易定量，便于比較不同菌株間致病力的差異。
   
　　本研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉JLC 50134感染小鼠后，生存率下降最快，造成的病理損害最為嚴(yán)重，而煙曲霉JLC 30566感染小鼠后，生存率下降較慢，病理損害較輕。說明JLC 50134和JLC 30566在致病力上存在顯著差異，認(rèn)為分別是致病力最強(qiáng)和最弱的菌株。目前認(rèn)為煙曲霉致病機(jī)制與很多因素相關(guān)，研究表明雖然宿主呼吸道內(nèi)的纖毛可以有效地清除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡內(nèi)，黏附于肺泡基底膜是感染的第一步〔9〕。同時(shí)機(jī)體的肺泡巨噬細(xì)胞在清除分生孢子并阻斷孢子萌發(fā)方面也有一定的作用。Paris等〔10〕發(fā)現(xiàn)煙曲霉黏附因子缺失突變株仍能在肺內(nèi)定植。而本研究在比較煙曲霉致病力差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)組織勻漿的菌落計(jì)數(shù)無顯著性差異，說明這幾株菌的分生孢子能夠黏附并定植于肺組織。這與Paris的研究結(jié)果相一致。因此，推斷菌株致病性可能與孢子的萌發(fā)、分泌水解酶和毒性代謝產(chǎn)物等作用相關(guān)。今后致病機(jī)制的相關(guān)研究將從這些方面深入細(xì)致地開展。