摘要食品中的病原微生物是影響食品安全的主要因素之一,傳統檢測食源性病原菌的方法繁瑣復雜、周期較長,隨著分子生物學技術和微電子技術等的發展,快速、簡便、特異的檢測方法成為研究目標。介紹并分析了幾種檢測食源性病原菌的方法及其特點,并就其發展歷程和應用進行闡述。
關鍵詞食源性病原菌;食品安全;檢測方法
AbstractPathogenic microorganism is one of the most primary factor which impacts on food safety. The traditional methods for detection of foodborne pathogens are quite complicated,and exhaust a considerable amount of time. With the development of molecular biology and microelectronic technique,the detection technology which is fast,simple and specific becomes the research target. Several methods and feature for detection the foodborne pathogens were introduced and analyzed. Then its developmrent history and application were elaborated.
Key wordsfoodborne pathogens;food safety;detection technology
農產品和食品安全是全球性問題,食源性疾病是食品安全的主要問題,世界衛生組織將其定義為:“凡是通過攝食進入人體的,使人體患感染性或中毒性的疾病。”這里包括了由食品微生物污染和化學性物質引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。近年來,國內外食源性疾病事件頻頻發生,如英國的瘋牛病、日本的雪印牛奶金黃色葡萄球菌中毒事件,法國的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引發的食物中毒事件,全世界每年發生食源性疾病的有數十億人,每年約有200萬兒童死于腹瀉。其中66%以上是由細菌性病原菌所致。其中動物源性食品中沙門氏菌、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、單增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。因此,對食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關注。其中,食源性病原微生物的檢測技術是預防與控制食源性疾病的關鍵技術環節。傳統微生物檢驗方法的最大弱點是耗時較長,難以滿足食品生產廠家特別是出口廠家檢測期較短的需求。目前國內外學者進行了大量的研究,在以抗體和核酸為基礎的檢測方法方面不斷取得進展,現將當前國內外實際應用的食源性病原微生物檢測主要技術簡要介紹如下。
1以免疫學反應為基礎的檢測技術
1.1免疫熒光標記
1.1.1原理與特點。免疫熒光技術是標記免疫技術中發展最早的一種。它以熒光素作為一種標記物標記抗體,依據熒光素所發出的熒光在熒光顯微鏡下對抗原進行細胞定位,確定抗原性質,并利用定量技術測定含量。該法把血清學的特異性、熒光色素的敏感性集為一體,因此具有特異性強、敏感性高、速度快的優點。主要缺點是非特異性染色問題尚未完全解決,使結果判定的客觀性不足,技術程序也還比較復雜[1]。
1.1.2應用。始創于20世紀40年代初,1942年Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體,檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。直至1958年Riggs等合成了性能較為優良的異硫氰酸熒光素,Marshall等又對熒光抗體標記的方法進行了改進,從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。1994年我國科學家孫洋等人成功利用此法檢測沙門氏菌。
1.2酶聯免疫吸附測定
1.2.1原理與特點。酶聯免疫吸附測定是把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理結合起來的一種檢測技術,通過顯色進行定位和定量分析。具有檢測靈敏度高、特異性強、準確性好、樣品處理量大等特點,而且可與其他技術偶聯而衍生出適用范圍更廣的新方法。
1.2.2應用。1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定用于IgG定量測定的文章,使得酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。Kryinski和Heimsch(1977)首次將ELISA用于食品沙門氏菌的檢測,并在應用中不斷得以發展,20世紀80年代Paadhye和許多學者都采用了ELISA進行食品沙門氏菌的檢測,但他們使用的多價血清不同程度地存在交叉反應,使ELISA產生較多的假陽性,在實踐中有一定的困難。20世紀80年代,單克隆技術問世和日趨成熟,文其乙等人(1995)在前人的基礎上應用沙門氏菌屬特異性單克隆抗體CB8和DE7建立了檢測沙門氏菌的直接ELISA方法,并形成了快速檢測試劑盒,已被應用于各種畜禽疾病診斷和環境樣品的檢測,成為一種常規的檢測方法。但到目前為止,大多數用于直接ELISA的抗體只具有屬特異性。
1.3免疫磁珠分離法
1.3.1原理與特點。免疫磁性分離技術是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面,與樣品中被檢致病菌發生特異性結合,載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下,向磁極方向聚集,棄去檢樣混合液,使致病菌不斷得到分離、濃縮,是從食品成分中分離靶細菌非常有效的方法。若能和其他檢驗方法如ELISA、PCR、FIA相結合,則可數倍地提高分離效率和檢測范圍。
1.3.2應用。如利用IMS技術對環境水樣本進行檢測,不進行過濾等預處理,能快速有效地探測環境中水的E.coli O157:H7,最低檢測限可達2×103個細胞/mL;利用IMS-PCR法,可在7 h內在5~100 L樣本中檢測也至少1個C.parvum卵囊,該方法的快速性和靈敏性足以使其勝任飲用水中C.parvum污染的常規檢測。在英國,此法主要應用于牛奶中E.coli O157:H7的監測和食品中單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小腸結腸耶爾森氏菌等的檢測。
1.4免疫金技術
1.4.1原理與特點。膠體金標記抗體,實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。增菌的陽性樣品沿著膜移動,被固定的載有染色劑的抗體將使抗原—抗體復合物著色,顯色程度與抗原含量成正比。其特點是靈敏度和特異性都較高,且操作簡便、快速,無污染,易于判讀。用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。金標免疫快速試驗的靈敏性與ELISA基本相近,許多試驗的敏感度都可達到1 ng/mL或更低水平,但是有些試驗則不能達到如此的敏感度,采用信號放大系統如生物素—鏈親和素系統,應用鏈親和素與生物素結合的四價性和極高的親和常數,可明顯提高靈敏度和穩定性[2]。
1.4.2應用。1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學,將抗沙門氏菌抗體與膠體金結合,用直接免疫細胞化學技術檢測沙門氏菌的表面抗原獲得成功。進入20世紀90年代,它已在生物醫學各領域得到日益廣泛的應用。目前有專門用來檢測食品及環境中沙門氏菌抗原、李斯特菌抗原的商品化檢測卡。
2分子生物學檢測方法
聚合酶鏈反應(PCR)是近十多年來應用最廣的分子生物學方法,在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質高度保守的核酸序列設計特異引物進行擴增。其大量研究表明,PCR在對食品中病原微生物的確證試驗方面與傳統培養方法相比至少具有相同的靈敏度,而多數情況下則表現出更高的靈敏度,陽性檢出率更高[3],而且檢測周期大為縮短。在PCR的不斷發展和應用中,以其為基礎的更多方法技術涌現出來,其中,多重PCR、 DNA指紋圖譜技術、熒光PCR、基因芯片技術、定量PCR等檢測技術應用最為廣泛。
目前部分常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應的商品試劑盒出售。主要有:BioControl公司的肉毒梭菌、大腸桿菌0157:H7、李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名Probelia)和Qualicon公司的大腸桿菌0157:H7、李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名BAX)等。
2.1多重PCR檢測技術
2.1.1原理與特點。多重PCR的建立,實現了多種食源性致病菌的同時檢測。多重PCR是指在同一個反應體系中,加入多對特異性引物,如果存在與各引物對特異性互補的模板,即可同時在同一反應管中擴增出1條以上的目的DNA片段,達到一次性檢測多種致病菌的目的。多重PCR既保留了常規PCR的特異性、敏感性,又減少了操作步驟及試劑使用量[4]。但也存在明顯的不足,例如擴增效率不高、敏感性偏低;擴增條件需摸索與協調;可能出現引物間干擾等。
2.1.2應用。Franket等[5]首先將多重PCR方法檢測產毒素性大腸桿菌基因?，F多重PCR方法已被用于同步檢測大腸桿菌、沙門氏菌、致病性弧菌等[6],鑒定與腸毒素有關的金黃色葡萄球菌菌株[7],研究李斯特菌種內分化等,結合富集培養,應用多重PCR方法甚至可以同時檢測13種不同的食源性病原微生物。
2.2DNA指紋圖譜技術
2.2.1原理與特點。DNA指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜,使目標微生物的核酸經PCR擴增后產生多條DNA擴增片段,這種電泳圖譜多態性豐富,具有高度的個體特異性和環境穩定性。指紋圖譜是鑒別菌種、種屬的有力工具,具有快、準確等優點。其中包括隨機引物擴增多態性DNA分析(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD),主要用于不考慮微生物核酸精確序列的情況下,比較微生物間的DNA指紋圖譜差異,用于細菌種間的鑒定、微生物的分子分型和鑒定。
2.2.2應用。國內有的機構采用RAPD技術對腸炎沙門菌進行分子分型,先將腸炎沙門菌接種SS平板并取其菌液作為RAPD多態性分析的DNA粗制模板,然后利用引物5’-CCGCAGCCAA-3’對菌株進行RAPD擴增反應并經過凝膠成像系統獲得RAPD圖像,再用軟件計算擴增片段的分子量大小和系統聚類分析。該方法為腸炎沙門菌食源性疾病的流行病學調查和溯源的同源性分析提供了技術支持。但是RAPD的不足之處是需對大量的隨機引物進行篩選。
2.3實時熒光定量PCR
2.3.1原理與特點。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中在探針上加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,是迄今為止定量最準確、重現性最好的定量方法,且自動化程度高,目前已得到廣泛應用。
2.3.2應用。我國科學家彭雁忠等(2005)已建立了一種能同時檢測空腸彎曲菌(CJ)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7、副溶血性弧菌(VP)和單核增生李斯特菌(LM)的多聯實時熒光PCR定量方法。
2.4DNA芯片技術
2.4.1原理與特點。DNA芯片是將大量寡核苷酸分子固定于固相支持物上組成的微點陣列。其檢測致病菌原理為:選擇細菌的共有基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC)作為靶基因,用1對通用引物進行擴增,再利用芯片上的探針檢測不同細菌在該共有基因上的獨特堿基。最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式區分不同的細菌,此法還可以通過向寡核苷酸探針陣列中添加相應的探針來逐步擴大基因芯片的檢測范圍。并通過增加和調整探針來逐步提高基因芯片的準確性。在食品衛生質量檢驗、臨床疾病診斷方面微陣列基因芯片的開發具有廣闊的應用前景[8]。
2.4.2應用。Carl等[9]在對4種細菌,即大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌和空腸彎曲菌采用基因芯片的檢測方法,其檢測結果不僅敏感度高于傳統方法,而且操作簡單,重復性好,并且節省了大量時間,大大提高了4種細菌的診斷效率。2001年,Call等[10]利用多重PCR和基因芯片技術成功檢測了大腸桿菌O157:H7。聶萌(2006)運用通用芯片技術平臺建立了快速、準確、高通量檢測食源性致病菌的方法。然而,基因芯片技術還有許多地方待改進,如檢測成本高昂,檢測特異性有待提高,樣品制備過程應該進一步簡化以及建立標準化程序等。
3生物傳感器
3.1原理與特點
生物傳感器主要由分子識別的固定化生物敏感膜和轉換信號的換能器2部分組成。當待測物質經擴散作用進入固定化敏感膜時,發生生物學反應,產生的信息被相應的轉換器轉變成可定量和可處理的電信號,并經儀表放大輸出,以電子計算機處理后,即完成對產生信號的檢測,由此獲得待測物質的種類及濃度。與傳統的化學傳感器和離線分析技術相比,生物傳感器有著許多不可比擬的優勢,如高選擇性、高靈敏度、較好的穩定性、低成本,可微型化、便于攜帶、可以現場檢測等。
3.2應用
烏普迪克等(1967)制出了第1個生物傳感器葡萄糖傳感器。在第2代生物傳感器(微生物、免疫、酶免疫和細胞器傳感器)的基礎上,國內外學者正研制和開發第3代生物傳感器,是將生物技術和電子技術結合起來的場效應生物傳感器。Liu等[11]用光學免疫傳感器實現了鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。Geng等[12]采用了以抗體為基礎的光纖免疫傳感器對熱狗和臘腸內少量的單增李斯特菌進行檢測,檢測低限為10~1 000 cfu/g,可在24h內完成。在現場快速檢測領域,生物傳感器技術與比色、免疫膠體金試紙、ELISA等檢測方法相比還未得到普遍應用,但國內外對這方面的報導很多,各種新技術如納米、分子印跡為其提供了豐富的發展空間,隨著檢測儀器和檢測方法的不斷成熟,生物傳感技術在食品現場快速檢測領域將有更廣闊的應用前景。
4討論與展望
長期以來,國內外不少實驗室對微生物標本的檢測方法做了進一步的改進和發展,但是還是從純培養的觀念出發,應用各種培養基,進行分離培養、形態檢查、生化反應和動物實驗等,盡管解決了不少問題,但其浪費人力、物力,而且需要2~3 d甚至更長的時間才能檢測結果,以致失去了對臨床工作的指導意義,從而不同程度地影響著它的使用價值。為此國內外該領域的研究人員都頗為重視應用免疫學技術、分子生物學技術和分子遺傳學技術與微型計算機相結合或以此為基礎拓展新方法,對細菌等各類微生物標本進行快速檢驗研究。這樣在檢測標本的過程中,既無需進行分離微生物或作純培養,也不需要作生化實驗等,而是應用上述技術對標本直接做檢測,以確定在標本內是否含有活細菌、細菌產物或抗原成分,定性并定量檢測,而且在2~3 h左右即可報告檢測結果,及時做出確切診斷。
免疫學方法一般需提供數量較多的純化細菌,或需對樣品進行濃縮后收集,以提高單位體積的含菌量,從而較難在短時間內得到檢測結果。但它不需要復雜儀器,所需設備簡單、易操作。在測定抗體的試驗中ELISA的陽性率與常規方法相似但測出抗體的時間較早,抗體滴度也較高,但在檢測抗原時,其敏感性尚不能完全令人滿意,說明該法還有進一步改進的必要。其中免疫膠體金快速診斷技術由于其無污染、便捷、靈敏、安全等特點,對致病菌的檢測研究有廣闊的應用前景。若能實現多元化,在同一膜上固定多種反應物,1次測定可同時得到1組結果,這對于檢測某些具有聯檢意義的物質具有很大的應用價值。但總體來看,快速檢測方法有時在衛生檢驗方面目前尚存在定性與精確定量難以兼顧的狀況。另外,每一種免疫學檢測模式都存在抗體與非抗原物質之間的非特異性反應,從而產生假陽性反應。此外,待檢抗原被樣品中一些物質或其他優勢菌群所掩蔽,會產生假陰性反應。為了避免這些誤差,可設置對照實驗進行證實。隨著分析化學技術的發展,很多儀器分析手段和方法如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜—質譜聯用(GC-MS)、液相色譜—質譜聯用(LC-MS/MS)等,已顯示出在微生物檢測中的潛力。這些方法不同于依賴微生物生物學特征的檢測方法,而是通過分析微生物的化學組成(生物標志物)來區分和鑒定微生物,開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。