摘 要 目的:研究微生物改良法測定紅細(xì)胞葉酸（RCF）的可靠性。方法:用本方法檢測不同疾病患者100例和健康自愿者50例的紅細(xì)胞葉酸含量。對高、低兩個質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的精密度、穩(wěn)定性及實驗相關(guān)性等指標(biāo)進(jìn)行評價。結(jié)果:本方法化學(xué)性能的評價表明:批內(nèi)變異系數(shù)為2.228%和3.620%，批間變異系數(shù)為5.12%和7.51%。各廠家的試劑相關(guān)性良好（r=0.9544，n=50）。50名健康自愿者測定結(jié)果表明RCF的正常參考值為586.3±69.6ng/mL。結(jié)論:本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠且操作簡便，實驗條件簡單，適宜于推廣。
關(guān)鍵詞 紅細(xì)胞葉酸;微生物改良法;巨幼細(xì)胞貧血
血液中的葉酸水平異常偏低，除與葉酸缺乏的巨幼細(xì)胞貧血有關(guān)外，還與胎兒神經(jīng)管缺陷有關(guān)，引起同型半胱氨酸血癥，可影響血管功能和增加卒中危險。因而血液中的葉酸水平的檢測受到高度重視。測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結(jié)合兩類，我們用微生物改良法對紅細(xì)胞葉酸（RCF）進(jìn)行了初步的研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株制備:購買耐氯霉素乳酸菌（NCIMB10463）凍干菌株。將凍干的菌株懸浮于5mL保養(yǎng)液37℃孵育18h后;混勻取1滴加入新的5mL保養(yǎng)液，37℃孵育18h（該菌株可以在-4℃保存2W，用于菌株的繁殖）后;混勻取0.5mL加入5mL保養(yǎng)液，37℃孵育6h后;用生理鹽水清洗5次，最后用5mL生理鹽水懸浮（簡稱清洗后6h菌株）。
1.1.2 測量液:按培養(yǎng)基2.35g，氯霉素0.02g，V-C0.1g，Tween-80（1∶10稀釋）0.1mL，去離子水100mL的比例配制，以5mL為單位分裝。
1.1.3 保養(yǎng)液:每升測量液中加標(biāo)準(zhǔn)葉酸10mL，按5mL/支分裝于無菌帶塞試管，置-20℃可保存1年。標(biāo)準(zhǔn)葉酸濃度:10ng/mL。
1.3 測定樣本
①定值高值質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)=2.252ng/mL，低值質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)=1.761ng/mL;分裝后于-70℃保存，保證質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)只凍融1次。②病人標(biāo)本，不同疾病患者100例及健康自愿者50例，年齡25歲～40歲。所有標(biāo)本均空腹，采肘靜脈血2mL～3mL，置EDTA干燥管內(nèi)，按1∶10比例稀釋在1%的V-C液中（稱V-C血）于-20℃貯存。
2 微生物測定法
2.1. 按表1和表2操作配制孵育試管。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管孵育前配制表2 紅細(xì)胞葉酸標(biāo)本孵育前配制
2.2. 上述試管在37℃孵育18h后，搖勻，用721-分光光度計（在波長λ=660mm處）比濁。以葉酸濃度為橫軸，以光密度值（OD值）為縱軸做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管1和試管2的OD值首先扣除同濃度空白對照管的OD值，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出該試管的葉酸值，標(biāo)本的V-C血RCF（ng/mL）=（試管1葉酸值×0.04+試管2葉酸值×0.02）/2。標(biāo)本的紅細(xì)胞葉酸值（RCF）按以下公式進(jìn)行計算:RCF（ng/mL）=［（V-C血RCF×10）/紅細(xì)胞壓積］ng/mL。
3 結(jié)果
3.1 精密度實驗
取高、低值質(zhì)控血清，平行測定20次，計算批內(nèi)CV，低值血清CV=2.228%，高值血清CV=3.620%。連續(xù)測20d，計算批間CV，低值血清CV=5.12%，高值血清CV=7.51%。
3.2 穩(wěn)定性實驗
按照菌株制備方法將凍干的菌株打開后，測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，測定高值、低值質(zhì)控的RCF值;同時用保養(yǎng)液使菌株長期保存。并分別在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保養(yǎng)液的菌株繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，測定高值、低值質(zhì)控的RCF值。高值質(zhì)控的CV=5.18%、低值質(zhì)控的CV=3.03%。
3.3 相關(guān)實驗
取50份標(biāo)本同時用本法與美國DPC公司提供的進(jìn)口的葉酸（固相非煮沸雙相計數(shù)）放免試劑盒對RCF進(jìn)行測定，相關(guān)系數(shù)r=0.9544。 3.4 正常參考值
選取50名年齡在25歲～40歲健康人標(biāo)本用本方法進(jìn)行紅細(xì)胞葉酸測定，用平均值±兩個標(biāo)準(zhǔn)差的方法進(jìn)行統(tǒng)計計算正常參考值，測定結(jié)果表明RCF的正常參考值為（586.3±69.6）ng/mL。
4 討論
葉酸在體內(nèi)代謝極為重要的單碳轉(zhuǎn)運中起著關(guān)鍵性作用。血液中的葉酸缺乏除與巨幼細(xì)胞貧血有關(guān)外，還與胎兒神經(jīng)管缺陷有關(guān)，引起同型半胱氨酸血癥［1］ ，可影響血管功能和增加卒中危險 ［2，3］ 。由于紅細(xì)胞內(nèi)所含葉酸濃度比血清所含
葉酸濃度高10倍～20倍，因而紅細(xì)胞葉酸比血清葉酸更能代表組織內(nèi)葉酸水平，當(dāng)組織內(nèi)葉酸水平已經(jīng)缺乏，但尚未出現(xiàn)巨幼細(xì)胞貧血時，紅細(xì)胞葉酸的測定對葉酸缺乏作出的決定更有價值 ［4］ ;而且血清葉酸的結(jié)果易受多種因素的影響，如:炎癥、肝病、腫瘤等 ［5］ 。因此雖然血清葉酸降低代表早期葉酸缺乏，但紅細(xì)胞葉酸減低，不受外來因素的影響，確實反映了組織葉酸水平的減低。
測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結(jié)合法兩類，后者操作簡單、靈敏、但是價格昂貴，目前國內(nèi)多數(shù)用于測定血清葉酸（SF）。當(dāng)肝腎功能受損時，葉酸可以聚合。這種聚合體用競爭結(jié)合法不能測定（除非這種聚合被解開）;但微生物改良法可以測定血液中總?cè)~酸值（包括上述聚合體），因此用微生物改良法能滿足臨床測定肝、腎受損病人的總?cè)~酸值。微生物改良法是經(jīng)典的方法，材料來源廣泛，并且用保養(yǎng)液可以使菌株長期保存。如果保存不當(dāng)，致使菌株受雜菌污染或死亡，可以重新購買凍干菌株，十分簡單便利地重新建立該實驗;不需要購買特殊儀器;對儀器和實驗條件要求較低;適用于大批標(biāo)本測定。本實驗觀察了長期保存的菌株，其實驗穩(wěn)定性良好;與美國DPC公司提供的進(jìn)口的葉酸（固相非煮沸雙相計數(shù)）放免試劑相關(guān)性顯著。因此便于在臨床上推廣使用。