摘 要 以黑暗鏈霉菌Streptomyce tenebrarius 163為出發(fā)菌株，應(yīng)用磁場、磁場復(fù)合吖啶橙、耐受氨甲酰-妥布霉素、磁場復(fù)合耐受氨甲酰-妥布霉素篩選得到5株高產(chǎn)菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后表明，其總效價(jià)與氨甲酰-妥布霉素均比出發(fā)菌株提高了25%以上.
Abstract A tobramycin-producing strain,Strepomyces tenebrarius 163 was mutated by magnetic field，magnetic field combined with acriding and resisted by carbamoyltobramycin,carbamoyltobramycin combined with magnetic field.Several high-yielding mutants were screened out.After flask rescreening,it is indicated that these mutants′ potency and the percentage of carbamoyltobramycin increased by above 25% than those of the parent strain.
Key words carbamoyltobramycin；nebramycin factor 5′;Strepomyces tenebraruis;mutation
妥布霉素是美國禮萊公司1969年自一株黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)的發(fā)酵液中分離到的尼拉霉素(nebramycin)復(fù)合物中的組分6，美國最初報(bào)道黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的尼拉霉素組分甚多，有1，1′，2，3，4，5，5′，6，7，8，9，10，11，12，13等15種組分.現(xiàn)在國內(nèi)用于生產(chǎn)妥布霉素的菌株只產(chǎn)生組分2(安普霉素)和組分5′(6″-0-氨甲酰-妥布霉素，CTB)，妥布霉素是由6″-0-氨甲酰-妥布霉素經(jīng)堿水解而得到的〔1〕.目前，美、英、日、中、匈等國家生產(chǎn)妥布霉素.
妥布霉素是世界上使用最廣泛的第二代氨基糖苷類抗生素之一.該品對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效，對吲哚陽性變形桿菌、克氏氣桿菌、假單孢菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌亦有很強(qiáng)抗菌活性，特別是對綠膿桿菌抗菌活性更強(qiáng)(比慶大霉素強(qiáng)2～4倍)，且對慶大霉素耐藥的部分綠膿桿菌有效且毒性更低.硫酸妥布霉素(商品名Nebcin)用于治療呼吸道感染、皮膚、軟組織和骨、尿道和腹內(nèi)感染、敗血癥等的總有效率在85%以上〔2〕.妥布霉素亦可用于治療嚴(yán)重的G+、G-菌引起的混合感染，與羧芐青霉素合用抗綠膿桿菌有協(xié)同作用.妥布霉素對第八對腦神經(jīng)的耳毒性比新霉素、慶大霉素等低得多.
妥布霉素為一白色粉末，堿性，有吸濕性，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯和氯仿.妥布霉素在室溫及37℃、pH3～11時(shí)穩(wěn)定，其溶液在熱壓器中加熱20 min不失抗菌活性，無紫外吸收，有典型的氨基糖苷類紫外吸收光譜。
國內(nèi)妥布霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生二個(gè)組分2、5′，由于提取、精制的步驟復(fù)雜，成本較高，制約妥布霉素生產(chǎn)和應(yīng)用，因此，篩選總效價(jià)及組分5′含量高的優(yōu)良菌株對妥布霉素的生產(chǎn)無疑具有重要的意義.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，磁場對微生物的生長繁殖有較大的影響，可以改變微生物的生長情況〔3〕；通過抗自身代謝產(chǎn)物可以提高抗生素的產(chǎn)量〔4〕.本實(shí)驗(yàn)采取上述方法處理出發(fā)菌株，獲得產(chǎn)氨甲酰-妥布霉素組分5及總效價(jià)高的高產(chǎn)菌株.
1 材料與方法
1.1 菌種
出發(fā)菌株為黑暗鏈霉菌163(S.tenebrarius 163)，總效價(jià)為3 900 μ/mL，氨甲酰-妥布霉素組分含量為45%；檢定菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis1.339)和金黃色葡萄球菌，用于生物效價(jià)測定及薄層法生物顯影，確定組分.
1.2 培養(yǎng)基
斜面及分離培養(yǎng)基：高氏1號合成培養(yǎng)基.
種子培養(yǎng)基：葡萄糖，蛋白胨，酵母膏，氯化鈉.
發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，黃豆餅粉，花生餅粉，玉米淀粉，硫酸鎂，硫酸銨，碳酸鈣等.
1.3 誘變方法
1.3.1 磁場誘變處理
吸取單孢子懸浮液0.8 mL于內(nèi)徑為5 mm小玻璃管內(nèi)，置于7 000 GS磁場中，37℃振搖16 h，然后稀釋涂布在分離培養(yǎng)基的平板上，37℃避光培養(yǎng).
1.3.2 磁場復(fù)合吖啶橙誘變處理
將經(jīng)過磁場誘變處理的孢子懸浮液稀釋涂布在含一定濃度的吖啶噔的分離培養(yǎng)基平板上，37℃避光培養(yǎng).
1.3.3 耐受自身產(chǎn)物的處理
將孢子懸浮液稀釋涂布在含有一定濃度的氨甲酰-妥布霉素的分離培養(yǎng)基平板上，37℃避光培養(yǎng).
1.4 篩選
1.4.1 點(diǎn)種
分離培養(yǎng)基平板上長好的菌落用牙簽點(diǎn)種于預(yù)先鋪好的分離培養(yǎng)基平板上，每個(gè)菌落點(diǎn)種2次，并做好編號.每次誘變處理至少要點(diǎn)種100個(gè)菌落.經(jīng)點(diǎn)種的分離培養(yǎng)基平板于37℃避光培養(yǎng)2～3天.
1.4.2 打塊，保濕培養(yǎng)
將經(jīng)點(diǎn)種的分離培養(yǎng)基平板上剛剛長好的菌落打塊，放在無菌空平皿上，編號，37℃避光保濕培養(yǎng)至菌落成熟，孢子豐滿.
1.4.3 固體初篩
將保濕培養(yǎng)得到的源于同一菌落的瓊脂塊分別放在混有枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的檢定盤上，37℃培養(yǎng)18 h.設(shè)在枯草芽孢桿菌檢定盤上抑菌圈直徑為D1，在金黃色葡萄球菌的檢定盤上抑菌圈直徑為D2，選取二者直徑大的菌株，即得到總效價(jià)及氨甲酰-妥布霉素組分含量高的菌株傳母斜面，37℃避光培養(yǎng).
1.4.4 發(fā)酵初、復(fù)篩
將成熟母斜面的菌株全部上搖瓶發(fā)酵，選取總效價(jià)及氨甲酰-妥布霉素組分含量高的菌株傳子斜面，再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩.方法同上.
1.5 總效價(jià)測定
采用生物測定法.初篩用單劑量紙片法.復(fù)篩用二劑量管蝶法(參照中國藥典1995年版二部附錄).
1.6 組分測定
采用硅膠G薄層層析法測定發(fā)酵液中活性物質(zhì)的組分.溶劑系統(tǒng)為丁酮∶乙醇∶氨水(1∶1∶1）.展層完畢，取出，吹干，扣在表面鋪有定量濾紙的檢定盤上，30分鐘后取下，37℃培養(yǎng)16～18 h.比較兩個(gè)組分所產(chǎn)生的抑菌圈面積大小，計(jì)算氨甲酰-妥布霉素組分的含量.
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 磁場誘變處理
磁場已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)和生物工程等方面得到廣泛的應(yīng)用，我室首先將其用于麥迪霉素、慶大霉素的研究中，均得到了高產(chǎn)菌株〔5〕.根據(jù)磁場誘變劑量與死亡率的關(guān)系的預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定7 000 GS磁場強(qiáng)度為誘變劑量，該劑量的菌種死亡率為78.9%，光禿型菌落出現(xiàn)頻率為13.6%.
2.2 磁場復(fù)合吖啶橙誘變處理
文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，在黑暗鏈霉菌的高產(chǎn)菌株篩選中，添加不影響微生物生長的氮蒽類染料，可以引起幾乎所有的菌株產(chǎn)生的復(fù)合物含量比例的改變.S.cremeus Var.tob菌株篩選的分離培養(yǎng)基中加入0.5～2 μg/mL吖啶橙，可使組分2(安普霉素)被抑制50%，而組分5′(氨甲酰-妥布霉素)可提高15%～20%.另外，王魯燕〔7〕在妥布霉素高產(chǎn)菌株篩選中使用了吖啶橙(0.5 μg/mL)取得了較好結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)決定用磁場復(fù)合吖啶橙進(jìn)行誘變處理.
表1 分離平板中吖啶橙的劑量
對菌種S.tenebrarius 163生長的影響
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吖啶橙劑量C／μg5mL-1
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0.2
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0.5
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1.0
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2.0
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死亡率/%
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11.0
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12.7
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18.4
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26.3
|
|
光禿型菌落出現(xiàn)頻率/%
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16.7
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17.3
|
19.2
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27.6
|
首先確定分離培養(yǎng)基中吖啶橙的劑量，結(jié)果(見表1)顯示，吖啶橙在0.2～1.0 μg/mL濃度之間菌種死亡率較低，且變化不大，對生長無明顯影響.當(dāng)用上述濃度吖啶橙和磁場做復(fù)合處理時(shí)，菌種死亡率為87.6%～93.4%，而用2.0 μg/mL吖啶橙處理時(shí)，菌種死亡率高達(dá)99.6%以上，故選定分離培養(yǎng)基中吖啶橙的劑量為1.0 μg/mL與磁場復(fù)合處理菌種，結(jié)果見表2.
2.3 耐受自身產(chǎn)物——氨甲酰-妥布霉素的處理
2.3.1 固體耐受氨甲酰-妥布霉素
固體耐受氨甲酰-妥布霉素劑量的確定，見表3.
結(jié)果顯示，固體耐受氨甲酰-妥布霉素劑量增大，菌株生長速度減慢.如培養(yǎng)至第三天，可見耐受1000 μ/mL的分離平板上菌落長出，第四天耐受2000 μ/mL的菌落長出；到第六天和第八天才可見有極少數(shù)的菌落在耐受3000 μ/mL、4000 μ/mL的分離平板上長出.隨著耐受劑量的提高，菌株死亡率增大，光禿型菌株出現(xiàn)頻率增高，且菌株形態(tài)變異率高.故選擇固體耐受劑量為2 000μ/mL來處理S.tenebrarus 163，篩選結(jié)果見表2.
2.3.2 磁場復(fù)合耐受自身產(chǎn)物的處理
將磁場7 000GS處理16 h的單孢子懸浮液涂布在含有氨甲酰-妥布霉素1 500 μ/mL的分離平板上，菌種死亡率達(dá)95.0%，篩選結(jié)果見表2.
各種處理方法篩選結(jié)果見表2.
表2 各種處理方法得到的菌株篩選結(jié)果
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菌株編號
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總效價(jià)提高百分率/%
|
CTB提高百分率/%
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菌株編號
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總效價(jià)提高百分率/%
|
CTB提高百分率/%
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MF*-030
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32.8
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14.8
|
MFAO-129
|
76.6
|
27.5
|
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MF-006
|
41.4
|
15.5
|
RT***-032
|
2.3
|
26.6
|
|
MF-118
|
11.5
|
16.2
|
RT-009
|
18.6
|
19.4
|
|
MF-114
|
34.0
|
14.0
|
RT-024
|
-11.2
|
25.5
|
|
MF-241
|
15.5
|
15.8
|
RT-115
|
8.5
|
24.7
|
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MFAO**-037
|
17.4
|
21.7
|
RT-105
|
33.7
|
25.1
|
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MFAO-073
|
22.2
|
26.6
|
RT-223
|
3.8
|
32.4
|
|
MFAO-105
|
64.0
|
35.4
|
RT-224
|
14.5
|
20.3
|
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MFAO-108
|
29.9
|
11.3
|
MFRT****-213
|
36.6
|
28.1
|
|
MFAO-128
|
66.5
|
-3.9
|
MFRT-216
|
33.6
|
38.2
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*磁場誘變篩選得到的菌株；**磁場復(fù)合吖啶橙篩選得到的菌株；
***耐受氨甲酰-妥布霉素篩選得到的菌株；****磁場復(fù)合耐受氨甲酰-妥布霉素篩選得到的菌株表3 不同劑量氨甲酰-妥布霉素對S.tenebrarius 163的處理結(jié)果
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劑量C／μ5mL-1
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死亡率/%
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光禿型出現(xiàn)頻率/%
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500
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21.7
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11.3
|
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1000
|
66.5
|
18.2
|
|
2000
|
91.7
|
25.4
|
|
3000
|
95.8
|
37.6
|
|
4000
|
99.9
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55.1
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3 討論
a.本實(shí)驗(yàn)所用到的各種處理方法，從篩選結(jié)果看，應(yīng)用磁場誘變處理菌種，總效價(jià)提高幅度要高于CTB提高的幅度；磁場復(fù)合吖啶橙處理菌種，總效價(jià)、CTB含量可再提高一步，得到MFAO-105、MFAO-129等較好的菌株，它們的總效價(jià)、CTB含量均提高了64.0%和27.5%；耐受自身產(chǎn)物處理菌種，CTB組分的提高幅度要大于效價(jià)提高幅度，CTB含量提高20%～30%，而總效價(jià)只提高了10%～20%；當(dāng)磁場和耐受自身產(chǎn)物復(fù)合處理時(shí)，兩種處理因子對高產(chǎn)菌株的篩選有協(xié)同作用，即總效價(jià)和CTB的含量均有較大幅度提高，如MFRT-213的總效價(jià)提高了36.6%，CTB含量提高了28.1%，MFRT-216總效價(jià)提高了33.6%，CTB組分含量提高了38.2%，用以上這種方法處理得到了比較滿意的高產(chǎn)菌株，其總效價(jià)可達(dá)6500 μ/mL以上，CTB組分含量可達(dá)80%以上.
b.本實(shí)驗(yàn)固體篩選用到的金黃色葡萄球菌是經(jīng)過誘變處理得到的具有耐受安普霉素、而對氨甲酰-妥布霉素敏感的菌株，該菌株最高可耐受4 000 μ/mL安普霉素而不產(chǎn)生抑菌圈，對妥布霉素敏感，在含1 000 μ／mL妥布霉素的平板上可產(chǎn)生直徑為15～19 mm的抑菌圈.因此，在固體篩選過程中只要挑取在金黃色培養(yǎng)球菌和枯草桿菌檢定盤上抑菌圈直徑都大的菌落就可以篩選到高效價(jià)、高CTB組分的菌株.事實(shí)上，表2中所列的菌株都是經(jīng)過這一步驟篩選得到的.