目的：探討吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）原生質體形成的影響因素。方法：用溶菌酶處理S.hygroscopicus FC904的菌絲體，比較在不同條件下原生質體的形成數。結果：S.hygroscopicus FC904在不同條件下原生質體的形成數不同,其原生質體形成的最適條件為：在菌絲體生長培養基中添加0.7%甘氨酸及10%的蔗糖；采用生長旺盛期的菌絲體制備原生質體；溶菌酶適宜濃度為2mg/ml；溶菌溫度范圍30～37℃；溶菌前每毫升壓積菌絲體宜用P緩沖液5ml懸浮。結論：菌絲體生長培養基成分、菌齡、溶菌酶濃度、溶菌溫度是影響S.hygroscopicus FC904原生質體形成的主要因素。
關鍵詞：吸水鏈霉菌FC904 原生質體 制備
新型強效免疫抑制劑雷帕霉素以其強效低毒而備受世人注目。吸水鏈霉菌FC904（S.hygroscopicus FC904）是福建省微生物研究所分離的能產生雷帕霉素的菌株。本文摸索該產生菌原生質體形成的最適條件，為進一步進行誘變育種、原生質體融合以及遺傳學研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 菌株 S.hygroscopicus FC904
1.2 菌絲體培養基 由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O組成。
1.3 主要試劑 甘氨酸(上海新華化工廠),溶菌酶（上海伯奧生物科技公司）,原生質體緩沖液（P緩沖液）按文獻［1］配制。
1.4 原生質體制備
在菌絲體生長培養基中添加10%蔗糖及0.7%甘氨酸，移種入孢子斜面培養物，于26℃振蕩培養（200r/min）42～46h；離心收集菌絲體，加入P緩沖液洗滌菌絲體兩遍,每遍離心（3000r/min）10min，棄上清液；每毫升壓積菌絲體加入P緩沖液5ml懸浮；加入溶菌酶（P緩沖液配制，25nm纖維微孔濾膜過濾,終濃度2mg/ml）,30～37℃作用60min，其間每隔15min用無菌吸管吹打以利原生質體釋放,并取樣用顯微鏡觀察原生質體形成情況。酶解結束用差速離心除去未酶解菌絲體，過濾收集原生質體，用血細胞計數器計數，比較在不同因素下原生質體的形成數。
2 結 果
在添加有甘氨酸及蔗糖的培養基中生長的菌絲體有利于制備原生質體，其濃度以甘氨酸0.7%及蔗糖10%最為適宜。不同菌齡的菌絲體對溶菌酶的敏感度不同，處于生長旺盛期（菌齡42～46h）的菌絲體最有利于該菌株原生質體的形成。適合于該菌株原生質體形成的溶菌酶濃度為2mg/ml,繼續提高溶菌酶濃度，原生質體形成數不再提高。有利于S.hygroscopicus FC904原生質體形成的適宜溫度范圍為30～37℃。溶菌前的菌絲體密度也會影響溶菌效果，離心后每毫升壓積菌絲體宜加P緩沖液5ml懸浮（表1,2）。
表1 不同因素對S.hygroscopicus FC904原生質體形成的影響
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影響因素
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平均原生質體數(個/ml)
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甘氨酸+蔗糖濃度(%)
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0.1+1
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0
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0.5+5
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4.6×107
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0.7+5
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9.5×107
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0.7+10
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4.5×108
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0.7+20
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2.2×108
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菌齡（h）
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24～30
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0
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42～46
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3.8×108
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50～54
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3.0×105
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溶菌酶濃度(mg/ml)
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0.5
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0
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1.0
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6.5×105
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2.0
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4.1×108
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4.0
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4.6×108
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溶菌溫度(℃)
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26
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4.5×105
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30
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3.6×108
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37
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表2 菌絲體密度對S.hygroscopicus FC904原生質體形成的影響
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菌絲體壓積∶P緩沖液體積
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平均原生質體數(個/ml)
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1∶2
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7.7×105
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1∶5
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4.3×108
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1∶8
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3 討 論
原生質體無細胞壁，有利于生化或遺傳操作。原生質體的分離依賴于菌絲細胞壁在裂解酶中的降解，同時受菌絲體培養基的成分、菌齡、溶菌酶濃度及酶解溫度等因素的影響。由于不同微生物的遺傳及生理特征各不相同，因此，原生質體的分離制備因種而異，必須摸索適合于各自菌株的最佳原生質體形成條件。
(1)在添加適當濃度的甘氨酸及蔗糖的培養基中生長的菌絲體有利于制備原生質體。細胞壁肽聚糖中的四肽側鏈由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸和D-丙氨酸組成［2］，甘氨酸可以替代肽聚糖中的D-丙氨酸，從而影響細胞壁之間的相互交聯，而蔗糖則可能會擾亂菌體生長時的代謝過程［3］。因此，甘氨酸和蔗糖在抑制菌絲體生長的同時也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性，在二者之間必須尋找一個適宜的濃度。對S.hygroscopicus FC904來說，菌絲體生長培養基中添加0.7%甘氨酸與10%蔗糖，最有利于S.hygroscopicus FC904原生質體的形成。
（2）有報道太長菌齡的菌絲壁易老化增厚，不利于原生質體的釋放，太短菌體易破裂，原生質體釋放量減少［4］。本文結果也表明菌齡適中，處于對數生長期的菌絲體最有利于該菌株原生質體的形成。
（3）實驗表明，溶菌酶濃度＞2mg/ml、溶菌溫度30～37℃都有利于制備原生質體，但是最佳溶菌酶濃度及溶菌溫度應盡可能選擇較低者，因為溶菌酶濃度及溶菌溫度越高，原生質體越不穩定且易破裂，造成再生困難［3］。
（4）溶菌前菌絲體密度太大也不利于溶菌，因為同等菌量的菌絲體在相同的溶菌酶濃度下，菌絲體密度越大，所用的溶菌酶量就越少。