β-木糖苷酶測定試劑盒 微量法
測定意義:β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細菌和真菌等生物體,是催化木聚糖類半纖維素降解的關鍵酶,產物木糖可作為碳源應用于微生物發酵。另外,β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應用于造紙工業,比傳統的漂白法環保,具有廣泛的應用價值。
測定原理:β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產生對硝基苯酚,對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰,測定405nm光吸收增加速率,可計算β-木糖苷酶活性。
需要的儀器,耗材:天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
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β-木糖苷酶測定試劑盒 微量法
一、粗酶液提取: 1. 植物樣本:稱取約 0.1g 樣品,加 1mL 提取液充分冰浴勻漿,然后 12000rpm,4℃,離心 20min,棄沉淀 ,取 20μL 上清測定蛋白含量,剩余上清作為待測酶液。 2. 細菌、真菌樣本:收集約 500 萬個細胞,加入 1mL 提取液,超聲波破碎(冰浴,功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 10000rpm,4℃,離心 10min,棄沉淀 ,取 20μL 上清測定蛋白含量,剩余上清置于冰上待測。 3. 標準液的處理:用試劑二將標準液稀釋 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0μmol/ml。二、測定操作表: 1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長 405nm,對照管調零。 2、操作表對照管 測定管 標準管酶液(μL) 40 40 40 試劑一(μL) 10 試劑二(μL) 80 70 80 混勻,45℃水浴 20min 試劑三(μL) 80 80 80 混勻,靜置 5min,對照管調零, 微量石英比色皿/96 孔板,測定 405nm 吸光值,記為 A405。
β-木糖苷酶測定試劑盒 微量法
β-木糖苷酶活性計算公式:根據標準管的吸光度(x)和濃度(y,μmol/ml)建立標準曲線,將△A帶入標準曲線中,計算 樣品生成的產物量(μmol/ml)。 1、按蛋白含量計算酶活定義:45℃,pH7.4 時,每毫克蛋白質 1min 內催化產生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。 β-木糖苷酶活性(μmol/min / mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=0.25×y÷Cpr 2、按樣本質量計算:酶活定義:45℃,pH7.4 時,每克樣品 1min 內催化產生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。 β-木糖苷酶活性(μmol/min /g)=(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=0.25×y ÷W 3. 按細胞數量計算:酶活定義:45℃,pH7.4 時,每 10 4個細胞 1min 內催化產生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。 β-木糖苷酶活性(μmol/min /10 4cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.0005×y Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.2mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.04mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質量,g; 500:細胞或細菌總數, 500 萬;T:反應時間,20min。