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　　隨著20世紀(jì)80年代無機(jī)鹽農(nóng)藥和有機(jī)氯農(nóng)藥的相繼禁用，菊酯類農(nóng)藥已發(fā)展為我國(guó)現(xiàn)階段使用最廣泛的農(nóng)藥之一，由于具有廣譜、內(nèi)吸、觸殺等高效殺蟲特性，因此廣受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者歡迎。但是，大量使用引起的農(nóng)藥殘留不僅造成環(huán)境與食品的污染，而且影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量及人們的身體健康。農(nóng)藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學(xué)降解和光降解等方式。與其他的降解方式相比，微生物降解具有操作簡(jiǎn)單、降解徹底、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此利用微生物技術(shù)處理農(nóng)藥殘留，并對(duì)受污染的土壤與水體進(jìn)行生物修復(fù)是一種行之有效的方法。目前對(duì)有機(jī)磷和有機(jī)氯等農(nóng)藥的微生物降解的研究比較多，而關(guān)于菊酯類農(nóng)藥的降解研究較少。本文從農(nóng)藥廠的污泥中采集土壤樣品，篩選分離到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J2），并對(duì)其進(jìn)行篩選、鑒定及降解性能的初步研究［13］。

　　1材料與方法

　　1.1培養(yǎng)基
      
　　富集培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g、NaCl 2.0 g、KH2PO4 1.5 g、葡萄糖1.0 g、dH2O 1 000 mL，pH值7.0；經(jīng)115 ℃，滅菌20 min。基本培養(yǎng)基（1 L）：NH4Cl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.5 g ，加入氯氰菊酯作為唯一碳源，濃度視需要添加。LB液體培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 5 g，pH值7.0（固體加2%的瓊脂粉）。

　　1.2實(shí)驗(yàn)試劑
   
　　氯氰菊酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）原藥和標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9 %，色譜純）購自成都化學(xué)試劑公司；Taq DNA聚合酶與各種限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物；3S DNA Gel Purification kit V3.1 購自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亞合成；pMD18T載體試劑盒購自大連寶生物。

　　1.3降解菌株的富集和分離
   
　　將采集的農(nóng)藥污染土樣配制成15%的懸浮液，以5%的接種量接到含25 mg/L氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基中，并加適量玻璃珠，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，取1 mL菌液接入同樣培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，傳代過程中氯氰菊酯的濃度逐步增高至300 mg/L,大約2 d傳代1次。將富集的農(nóng)藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5 、10-6）稀釋，分別取0.2 mL懸液涂布在含有50 mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)；當(dāng)平板出現(xiàn)菌落時(shí)，將單菌落在無機(jī)鹽農(nóng)藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長(zhǎng)快、菌落規(guī)則、傳代穩(wěn)定的單菌落斜面保存。將初篩純化的斜面單菌落接入含有50 mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min培養(yǎng)2 d，測(cè)定其降解率。

　　1.4菌株的鑒定
   
　　菌株的形態(tài)及生理生化特性參照文獻(xiàn)［4,5］進(jìn)行，并采用bioMerieux Vitek全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，菌株16S rDNA的克隆及序列測(cè)定和比較參照文獻(xiàn)［6］，提取J2的基因組DNA作為模板，進(jìn)行菌株J2的16S rDNA擴(kuò)增，PCR引物分別為：引物1：5’AGACTTTGATCCTGGCTCAG—3’； 引物2：5’CGGCTACCTTGTTACGACTTC3’； 25 μL的體系為：模板DNA 1 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，10×擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）2.5μL，Taq酶（5U/μL）0.51μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s ，52 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；72 ℃ 延伸8 min。用PCR回收試劑盒回收16S rDNA片段并連接到T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑選白斑菌落進(jìn)行插入片段的酶切驗(yàn)證；測(cè)序由上海博亞公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上通過blastn軟件與GeneBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析比較。

　　1.5氯氰菊酯含量的測(cè)定［7-9］
   
　　采用氣相色譜法，取培養(yǎng)液3 mL，移入10 mL具塞刻度試管，分別加入5 mL的石油醚，劇烈震蕩10 min，靜置2 h，重復(fù)2次，取上層有機(jī)相加入無水硫酸鈉吸水，并定容，再用氣相色譜儀（VARIAN CP3800）檢測(cè)。檢測(cè)條件：檢測(cè)器為FID，柱HP5（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫采用程序升溫，起始溫度150 ℃，以30 ℃/min升溫至250 ℃，保持15 min，載氣為氮?dú)猓w積分?jǐn)?shù)99.999%）,流量為40 mL/min，進(jìn)樣量為0.8 μL,FID檢測(cè)器溫度290 ℃，進(jìn)樣口溫度260 ℃，分流比為50。氯氰菊酯的降解率按下式計(jì)算：降解率=對(duì)照樣品殘留量－處理樣品殘留量 對(duì)照樣品殘留量其中，對(duì)照為不接降解菌或不加降解酶的同樣反應(yīng)體系。

　　1.6菌株培養(yǎng)
   
　　從 4 ℃保存的J2菌株斜面接一環(huán)于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)10 h左右，以此為種子液（OD600控制在1.5左右，下同）。菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定：準(zhǔn)確量取10 mL培養(yǎng)菌液于已稱重的EP管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,用無菌dH2O洗滌2次,小心去上清,所得的菌體在85 ℃烘烤箱中烘至恒重，電子分析天平稱重。

　　2結(jié) 果

　　2.1高效降解菌的分離和篩選
   
　　采集樣品3份，經(jīng)富集和馴化，將樣品稀釋后涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，選擇平板上共篩選到7株細(xì)菌。將這7株細(xì)菌分別接種于含有50 mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定氯氰菊酯的降解率，其中菌株J2對(duì)氯氰菊酯的降解率最高(94.2%),見表1。

　　表1分離的細(xì)菌菌株對(duì)氯氰菊酯的降解率　略

　　2.2高效降解菌株的初步鑒定
   
　　該降解菌株屬革蘭陰性菌，兼性厭氧菌，呈球桿狀，單個(gè)或短鏈狀排列，長(zhǎng)0.9～1.2 μm, 寬2.1～2.5 μm，不形成芽孢，有莢膜。在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h的菌落直徑為0.5 mm，呈半球形，半透明，濕潤(rùn)，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陰性；VP反應(yīng)顯陽性；三糖鐵瓊脂試驗(yàn)不產(chǎn)生H2S；其他生理生化特性見表2。

2.3菌株16S rDNA的序列分析
   
　　以菌株J2的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 514 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1），測(cè)序后在GenBank上登錄，登錄號(hào)為AY989899。根據(jù)同源性比較，菌株J2與Genebank中的Klebsiella pneumoniae strain 2 (登錄號(hào)為DQ444287.1)和Klebsiella pneumoniae strain mcp11 d(登錄號(hào)為EF419182.1)  的同源性為99%。因此根據(jù)以上形態(tài)特征和生理生化特性,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)［10］以及16S rDNA序列同源性比較結(jié)果,將菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J2。

　　表2分離株J2的部分生理生化特性　略

　　圖1菌株J2的16S rDNA　略

　　2.4氯氰菊酯濃度對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響
   
　　在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯，使其終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L。按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復(fù)3次,37 ℃下160 r/min培養(yǎng)2 d，取樣10 mL測(cè)定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖2。從圖2可知，當(dāng)氯氰菊酯濃度低于200 mg/L時(shí)，菌株Klebsiella sp.J2可以對(duì)氯氰菊酯進(jìn)行降解；同時(shí)，隨著氯氰菊酯濃度的提高，其生長(zhǎng)也逐步提高，在200 mg/L時(shí)達(dá)到最大值；而當(dāng)氯氰菊酯濃度超過250 mg/L時(shí)，菌株Klebsiella  sp.J2細(xì)胞由于受到氯氰菊酯毒性的作用，菌體的生長(zhǎng)受到抑制，因此，菌株的生長(zhǎng)和對(duì)氯氰菊酯的降解隨之下降，到400 mg/L時(shí)基本不能生長(zhǎng)，降解率也趨于零。

　　圖2氯氰菊酯濃度對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響　略

　　2.5溫度對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響
   
　　按種子培養(yǎng)液2 %的接種量接種于內(nèi)含100 mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下160 r/min培養(yǎng)2 d,每個(gè)處理重復(fù)３次，分別取樣10 mL，測(cè)定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖3。從圖3可知，在25～45 ℃之間，菌株Klebsiella sp.J2生長(zhǎng)和降解氯氰菊酯的效果較好，其中以35 ℃時(shí)最佳，氯氰菊酯降解率達(dá)95.21 %；在25 ℃以下及45 ℃以上時(shí)，菌體生長(zhǎng)較慢，氯氰菊酯降解率有不同程度的下降。

　　圖3溫度對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響　略

　　2.6 pH對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響
   
　　測(cè)定pH在5.0-10.0之間對(duì)菌株降解率的影響。分別配制pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液和甘氨酸氫氧化鈉緩沖液，加入NaNO3、KCl滅菌，冷卻后合并，分開滅菌的CaCl2、MgSO4·7H2O，使用前加入100 mg/L的氯氰菊酯。按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復(fù)３次,37℃下160 r/min培養(yǎng)2 d后，取樣10 mL測(cè)定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖4。從圖4可知，在pH 5.5-7.5之間，菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能比較好，最適pH為7.0，降解率為96.11%。
   
　　圖4pH對(duì)菌株Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解效能的影響　略

　　2.7菌株Klebsiella sp.J2的降解底物譜研究
   
　　按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種于含100 mg/L不同菊酯類農(nóng)藥和1 %葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,于37 ℃下160 r/min培養(yǎng)2 d后,取樣10 mL測(cè)定菌體生物量和不同菊酯類農(nóng)藥的降解率，結(jié)果見表3。從表3可知, 菌株Klebsiella sp.J2對(duì)各種菊酯類農(nóng)藥都有比較好的降解能力,特別是對(duì)氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明顯,而對(duì)氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯的降解作用則不明顯。

　　表3菌株Klebsiella sp.J2的降解底物譜研究　略

3結(jié) 論
   
　　通過富集培養(yǎng)從農(nóng)藥廠的污泥中分離到一株能以氯氰菊酯為唯一碳源生長(zhǎng)且能將其高效降解的細(xì)菌，經(jīng)生理生化試驗(yàn)及16S rDNA初步鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J2;對(duì)降解菌Klebsiella sp.J2的生長(zhǎng)和降解條件進(jìn)行了初步的研究，該菌株降解氯氰菊酯的最適溫度是35 ℃,最佳pH是7.0;降解菌Klebsiella sp.J2還能降解甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯等多種菊酯類農(nóng)藥。
   
　　4討 論
   
　　為了分離特定農(nóng)藥的降解菌，富集時(shí)以這種農(nóng)藥為唯一碳源和能源，只添加必要的無機(jī)鹽，在特定生長(zhǎng)條件下（即在某一選擇壓力下）長(zhǎng)期培養(yǎng)微生物，在此條件下生長(zhǎng)并且占優(yōu)勢(shì)的微生物一定能夠分解利用此條件中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。按照這一原理設(shè)計(jì)富集培養(yǎng)基，從長(zhǎng)期受菊酯農(nóng)藥污染的土壤中采集樣品，以此富集培養(yǎng)基連續(xù)富集馴化，在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物即能利用氯氰菊酯作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并在培養(yǎng)環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。
   
　　本文初步分析了不同的外界條件對(duì)菌株的降解效能的影響。結(jié)果表明，菌株對(duì)這些條件都有一個(gè)適宜的適應(yīng)范圍，在此范圍內(nèi)具有較好的降解力，超出了這個(gè)范圍，菌株的降解效能就受到影響。不同的條件具有不同的效果，這可能是由菌株的生理結(jié)構(gòu)及特性所決定的。因此在降解菌的開發(fā)利用過程中，應(yīng)該綜合考慮到這些因素的影響，并合理利用，以充分發(fā)揮菌株的降解效能。